MICROTOME
Microtome (dari mikros Yunani, yang berarti "kecil",
dan temnein , yang berarti "memotong")
adalah alat yang digunakan untuk memotong irisan bahan
yang sangat tipis, yang dikenal sebagai bagian. Penting dalam sains, mikrotom
digunakan dalam mikroskop, memungkinkan persiapan sampel untuk
pengamatan di bawah cahaya yang ditransmisikan
atau radiasi elektron.
Microtomes menggunakan baja,
kaca, atau pisau berlian tergantung pada spesimen yang diiris dan ketebalan
yang diinginkan dari bagian yang dipotong. Pisau baja digunakan untuk
menyiapkan bagian jaringan hewan atau tumbuhan untuk histologi mikroskop cahaya. Pisau kaca digunakan untuk mengiris bagian untuk mikroskop cahaya dan
untuk mengiris bagian yang sangat tipis untuk mikroskop elektron. Pisau berlian tingkat industri digunakan untuk mengiris bahan keras
seperti tulang, gigi dan materi tanaman untuk mikroskop cahaya dan mikroskop
elektron. Pisau berlian kualitas permata digunakan
untuk mengiris bagian tipis untuk mikroskop elektron.
Microtomy adalah metode untuk
persiapan bagian tipis untuk bahan-bahan seperti tulang, mineral dan gigi, dan
alternatif untuk electropolishing dan penggilingan ion. Bagian mikrotom dapat dibuat
cukup tipis untuk memotong rambut manusia di lebarnya, dengan ketebalan bagian
antara 50 nm dan 100 μm.
SEJARAH
Pada awal pengembangan mikroskop
cahaya, bagian dari tanaman dan hewan dipersiapkan secara manual
menggunakan pisau cukur. Ditemukan bahwa untuk mengamati
struktur spesimen yang diamati, penting untuk membuat potongan yang dapat
direproduksi bersih pada urutan 100 μm, di mana cahaya dapat ditransmisikan. Ini memungkinkan untuk pengamatan sampel menggunakan mikroskop cahaya
dalam mode transmisi.
Salah satu perangkat pertama
untuk persiapan pemotongan seperti itu ditemukan pada 1770 oleh George Adams,
Jr (1750-1795) dan dikembangkan lebih lanjut oleh Alexander Cummings. Perangkat ini
dioperasikan dengan tangan, dan sampel dipegang dalam sebuah silinder dan
bagian dibuat dari bagian atas sampel menggunakan engkol tangan.
Pada tahun 1835, Andrew Prichard mengembangkan model
berbasis tabel yang memungkinkan getaran diisolasi dengan menempelkan perangkat
ke meja, memisahkan operator dari pisau.
Kadang-kadang, atribusi untuk penemuan microtome
diberikan kepada ahli anatomi Wilhelm
His, Sr (1865), dalam bukunya Beschreibung eines Mikrotoms (Bahasa Jerman untuk Deskripsi Microtome ), Wilhelm
menulis:
“Peralatan telah memungkinkan presisi dalam
pekerjaan dimana saya dapat mencapai bagian yang dengan tangan saya tidak
mungkin buat. Yaitu telah memungkinkan kemungkinan mencapai bagian objek yang tidak
terputus dalam perjalanan penelitian.”
Sumber-sumber
lain lebih lanjut mengaitkan pengembangan dengan ahli fisiologi Ceko Jan Evangelista Purkyně. Beberapa sumber menggambarkan model Purkyne sebagai yang pertama digunakan
secara praktis.
Ketidakjelasan dalam
asal-usul mikrotom disebabkan oleh fakta bahwa mikrotom pertama hanya memotong
peralatan, dan fase pengembangan perangkat awal secara luas tidak berdokumen.
Pada akhir 1800-an,
pengembangan sampel yang sangat tipis dan tipis secara konsisten dengan
mikrotomi, bersama dengan pewarnaan selektif dari komponen sel penting atau
molekul memungkinkan untuk visualisasi detail mikroskop.
Saat ini,
sebagian besar mikrotom adalah desain pisau-blok dengan pisau berubah-ubah,
pemegang spesimen dan mekanisme kemajuan. Di sebagian besar perangkat, pemotongan sampel dimulai dengan memindahkan
sampel di atas pisau, di mana mekanisme kemajuan secara otomatis bergerak maju
sehingga pemotongan berikutnya untuk ketebalan yang dipilih dapat dilakukan. Ketebalan bagian dikontrol oleh mekanisme penyesuaian, memungkinkan untuk
kontrol yang tepat.
APLIKASI
Aplikasi mikrotom yang paling umum adalah:
1. Teknik Histologi Tradisional:
jaringan difiksasi, didehidrasi, dibersihkan, dan ditempelkan dalam parafin cair, yang
bila didinginkan membentuk blok padat. Jaringan kemudian dipotong dalam mikrotom dengan ketebalan bervariasi dari
2 hingga 50 μm. Dari sana jaringan
dapat dipasang pada slide mikroskop, diwarnai dengan pewarna berair yang tepat
(s) setelah pengangkatan parafin, dan diperiksa menggunakan mikroskop cahaya.
2. Prosedur
penampang beku : jaringan yang kaya air dikeraskan dengan
membekukan dan memotong dalam keadaan beku dengan mikrotom beku atau mikrotom cryostat ; bagian diwarnai dan diperiksa dengan mikroskop cahaya. Teknik ini jauh lebih cepat daripada histologi tradisional (5 menit vs 16
jam) dan digunakan bersama dengan prosedur medis untuk mencapai diagnosis cepat. Cryosections juga dapat digunakan dalam imunohistokimia karena
jaringan beku menghentikan degradasi jaringan lebih cepat daripada menggunakan fiksatif dan tidak
mengubah atau menutupi komposisi kimianya sebanyak mungkin.
3. Teknik Mikroskopi Elektron :
setelah menanamkan jaringan dalam resin epoksi, mikrotom yang dilengkapi dengan
pisau berlian kelas permata atau kaca digunakan untuk memotong bagian yang
sangat tipis (biasanya 60 hingga 100 nanometer). Bagian diwarnai dengan larutan garam logam berat yang sesuai dan diperiksa
dengan mikroskop
elektron transmisi . Alat ini sering disebut ultramicrotome . Ultramicrotome juga digunakan dengan pisau kaca atau pisau berlian kelas
industri untuk memotong bagian survei sebelum dipotong tipis. Bagian survei ini umumnya 0,5 sampai 1 μm tebal dan dipasang pada kaca
slide dan diwarnai untuk menemukan area yang menarik di bawah mikroskop cahaya
sebelum bagian tipis untuk TEM. Bagian tipis untuk TEM sering dilakukan dengan pisau berlian berkualitas permata. Melengkapi teknik TEM tradisional ultramicrotoma semakin banyak ditemukan
dipasang di dalam ruang SEM sehingga permukaan blok wajah dapat dicitrakan dan
kemudian dihapus dengan mikrotom untuk mengungkap permukaan berikutnya untuk
pencitraan. Teknik ini disebut Serial
Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBFSEM).
4. Teknik Microtomy Botani: bahan keras seperti
kayu, tulang, dan kulit membutuhkan mikrotom yang landai . Mikrotom ini memiliki bilah yang lebih berat dan tidak dapat dipotong
setipis mikrotom biasa.
5. Spektroskopi (khususnya FTIR atau Spektroskopi
infra merah): bagian polimer tipis diperlukan agar sinar infra merah akan
menembus sampel yang sedang diperiksa. Adalah normal untuk memotong sampel
dengan ketebalan antara 20 dan 100 μm. Untuk analisis yang lebih rinci dari area yang jauh lebih kecil di bagian
yang tipis, mikroskop FTIR dapat
digunakan untuk inspeksi sampel.
6. Microtome
laser: memotong spesimen target dengan laser femtosecond bukan pisau
mekanik. Metode ini bebas kontak dan
tidak memerlukan teknik persiapan sampel. Microtome laser memiliki kemampuan untuk mengiris hampir setiap jaringan
di negara asalnya. Tergantung pada bahan yang
sedang diproses, ketebalan irisan 10 hingga 100 μm layak.
JENIS
1. Sledge
Mikrotom sledge adalah perangkat di mana sampel
ditempatkan ke dudukan tetap (pesawat ulang-alik), yang kemudian bergerak maju
dan mundur melintasi pisau.
Mikrotom kereta luncur modern
memiliki kereta luncur yang diletakkan di atas bantalan linier, desain yang
memungkinkan mikrotom untuk dengan mudah memotong banyak bagian kasar. Dengan menyesuaikan sudut antara sampel dan pisau mikrotom, tekanan yang
diberikan pada sampel selama pemotongan dapat dikurangi. Aplikasi khas untuk
desain mikrotom ini adalah persiapan sampel besar, seperti yang tertanam dalam
parafin untuk persiapan biologis. Ketebalan potongan khas yang
dapat dicapai pada mikrotom sledge adalah antara 1 dan 60 μm.
2. Cryomicrotome
Untuk memotong sampel beku,
banyak mikrotom putar dapat disesuaikan untuk memotong dalam ruang nitrogen
cair, dalam apa yang disebut pengaturan cryomicrotome. Pengurangan suhu memungkinkan
kekerasan sampel ditingkatkan, seperti dengan menjalani transisi gelas, yang
memungkinkan persiapan sampel semi-tipis. Namun suhu sampel dan suhu pisau harus dikontrol untuk
mengoptimalkan ketebalan sampel yang dihasilkan.
3. Ultramicrotome
Ultramicrotome adalah alat utama ultramicrotomy . Ini memungkinkan
persiapan bagian yang sangat tipis, dengan perangkat berfungsi dengan cara yang
sama seperti mikrotom rotasi, tetapi dengan toleransi yang sangat ketat pada
konstruksi mekanis. Sebagai hasil dari konstruksi mekanik yang cermat,
ekspansi termal linier dari pemasangan digunakan untuk memberikan kontrol
ketebalan yang sangat baik.
Pemotongan yang sangat tipis ini penting untuk
digunakan dengan mikroskop elektron transmisi (TEM)
dan mikroskop elektron pemindaian
blok-wajah serial (SBFSEM), dan kadang-kadang juga penting
untuk mikroskop cahaya-optik. Ketebalan khas dari pemotongan ini
adalah antara 40 dan 100 nm untuk mikroskop elektron transmisi dan sering
antara 30 dan 50 nm untuk SBFSEM. Bagian tebal hingga 500 nm tebal juga diambil untuk
aplikasi TEM khusus atau untuk bagian survei mikroskop cahaya untuk memilih
area untuk bagian tipis akhir. Pisau berlian (lebih disukai) dan pisau
kaca digunakan dengan ultramicrotome. Untuk
mengumpulkan bagian, mereka melayang di atas cairan saat mereka dipotong dan
diambil dengan hati-hati ke grid yang cocok untuk melihat spesimen TEM. Ketebalan bagian
dapat diperkirakan dengan warna interferensi film tipis dari cahaya yang dipantulkan yang
dilihat sebagai hasil dari ketebalan sampel yang sangat rendah.
4. Microtome bergetar
Mikrotom bergetar beroperasi
dengan memotong menggunakan pisau bergetar, memungkinkan pemotongan yang
dihasilkan dilakukan dengan tekanan lebih sedikit daripada yang diperlukan
untuk pisau stasioner. Mikrotom getar
biasanya digunakan untuk sampel biologis yang sulit. Ketebalan
potongan biasanya sekitar 30-500 μm untuk jaringan hidup dan 10–500 μm untuk
jaringan tetap.
Variasi pada mikrotom bergetar
adalah mikrotom Compresstome. Compresstome menggunakan jarum spesimen atau
tabung "seperti lipstik" untuk menahan jaringan. Spesimen
jaringan benar-benar tertanam dalam agarosa, dan jaringan tersebut secara
perlahan dan lembut ditekan keluar dari tabung untuk memotong pisau bergetar. Perangkat
beroperasi dengan cara berikut: ujung tabung spesimen tempat jaringan muncul
sedikit lebih sempit daripada ujung pemuatan, yang memungkinkan
"kompresi" lembut jaringan saat keluar dari tabung. Kompresi ringan
mencegah pembentukan, pemotongan yang tidak rata, dan getaran artefak. Perhatikan bahwa
teknologi kompresi tidak merusak atau memengaruhi jaringan yang sedang dipotong.
Ada beberapa keuntungan dari
mikrotom Compresstome:
1)
Penanaman agarosa memberikan stabilitas pada seluruh spesimen di
semua sisi, yang mencegah pengirisan atau pemotongan jaringan yang tidak merata.
2)
Teknologi kompresi dengan lembut mengompres
jaringan bahkan untuk memotong, sehingga pisau tidak mendorong terhadap
jaringan.
3)
Bagian lebih cepat daripada kebanyakan mikrotom bergetar.
4)
Memotong
jaringan dari hewan yang lebih tua atau lebih dewasa dengan baik untuk
menyediakan jaringan yang lebih sehat.
5. Microtome gergaji
Mikrotom gergaji terutama untuk bahan keras
seperti gigi atau tulang. Mikrotom jenis ini memiliki
gergaji berputar tersembunyi, yang memotong sampel. Ketebalan potongan minimal sekitar 30 μm dan dapat dibuat untuk sampel
yang relatif besar.
6. Microtome laser
Microtome laser adalah alat untuk memotong tanpa kontak. Persiapan
awal sampel melalui penanaman, pembekuan atau fiksasi kimia tidak diperlukan, sehingga meminimalkan
artefak dari metode persiapan. Bergantian
desain mikrotom ini juga dapat digunakan untuk bahan yang sangat keras, seperti
tulang atau gigi, serta beberapa keramik. Bergantung pada
sifat material sampel, ketebalan yang dapat dicapai adalah antara 10 dan 100 μm.
Perangkat beroperasi menggunakan aksi pemotongan laser inframerah. Saat laser memancarkan radiasi dalam inframerah dekat,
dalam rezim panjang gelombang ini laser dapat berinteraksi dengan bahan
biologis. Melalui pemfokusan tajam probe dalam sampel, titik fokus
dengan intensitas sangat tinggi, hingga TW / cm 2 , dapat dicapai. Melalui
interaksi non-linear dari penetrasi optik di wilayah fokus, pemisahan material
dalam proses yang dikenal sebagai gangguan-foto diperkenalkan. Dengan membatasi
durasi pulsa laser ke kisaran femtoseconds, energi yang dikeluarkan di wilayah
target dikontrol dengan tepat, sehingga membatasi zona interaksi pemotongan
menjadi di bawah mikrometer. Di luar zona ini waktu aplikasi sinar ultra-pendek
memperkenalkan kerusakan termal minimal atau tidak ada pada sisa sampel.
Radiasi laser diarahkan ke sistem optik berbasis cermin pemindaian
cepat, yang memungkinkan pemosisian balok tiga dimensi, sekaligus memungkinkan
lintasan sinar ke wilayah yang diinginkan. Kombinasi daya tinggi dengan kecepatan raster yang tinggi
memungkinkan pemindai memotong area sampel yang besar dalam waktu singkat. Dalam mikrotom
laser laser-mikrodiseksi area internal dalam jaringan, struktur seluler, dan
jenis fitur kecil lainnya juga dimungkinkan.
